熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，簡稱qPCR)是一種革命性的分子生物學(xué)技術(shù)，它結(jié)合了傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和熒光檢測技術(shù)，能夠快速地對目標(biāo)DNA或RNA序列進(jìn)行定量分析，基本原理：
 

　　1.熒光探針法：利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物。這種方法特異性高，但操作相對復(fù)雜，需要設(shè)計(jì)特定的探針。
 

　　2.熒光染料法：在PCR反應(yīng)體系中加入過量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)射出熒光信號。這種方法簡便易行，適用于多種實(shí)驗(yàn)場景。
 

　　熒光定量PCR技術(shù)特點(diǎn)：
 

　　1.實(shí)時監(jiān)測：能夠在PCR反應(yīng)過程中實(shí)時監(jiān)測DNA的擴(kuò)增情況，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的出現(xiàn)時間及信號強(qiáng)弱，準(zhǔn)確測定目的DNA起始拷貝數(shù)。
 

　　2.高靈敏度與準(zhǔn)確性：具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠檢測到微量的DNA模板，并給出準(zhǔn)確的定量結(jié)果。
 

　　3.自動化程度高：結(jié)合了PCR技術(shù)和實(shí)時熒光檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了自動化操作，減少了人為誤差。

 

　　熒光定量PCR的應(yīng)用領(lǐng)域：
 

　　1.基因表達(dá)分析：用于檢測特定基因在不同組織、細(xì)胞或生理狀態(tài)下的表達(dá)水平。
 

　　2.病原體檢測：快速準(zhǔn)確地檢測病原體的存在和數(shù)量，如病毒、細(xì)菌等。
 

　　3.遺傳變異研究：用于檢測基因突變、SNP(單核苷酸多態(tài)性)等遺傳變異。
 

　　4.藥物研發(fā)：評估藥物對特定基因表達(dá)的影響，為藥物研發(fā)提供有力支持。
 

　　熒光定量PCR的使用注意事項(xiàng)：
 

　　-確保所有試劑和耗材的質(zhì)量可靠，避免使用過期或受污染的試劑。
 

　　-引物設(shè)計(jì)應(yīng)合理，避免引物間的二聚體或非特異性擴(kuò)增。
 

　　-根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的熒光標(biāo)記方法和探針類型。
 

　　-確保PCR儀的性能穩(wěn)定且校準(zhǔn)準(zhǔn)確。
 

　　-嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免交叉污染和誤操作。
 

　　-控制好實(shí)驗(yàn)條件，如溫度、濕度等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
 

　　-實(shí)時監(jiān)測熒光信號的變化情況，及時調(diào)整PCR反應(yīng)條件。
 

　　-及時清理PCR儀和工作區(qū)域，避免殘留物對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響。
 

　　-對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行仔細(xì)分析和解讀，注意排除異常值和誤差來源。
 

　　-定期維護(hù)和保養(yǎng)PCR儀和其他相關(guān)設(shè)備，延長使用壽命并保證性能穩(wěn)定。