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實時熒光定量PCR儀使用的基本步驟

更新時間:2022-04-12      點擊次數(shù):4344
  實時熒光定量PCR儀技術的原理:體外核酸擴增,加熱使雙鏈DNA解開螺旋,在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交,在Taq DNA聚合酶,dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸),Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物,重復“變性→退火一引物延伸”過程至25-40個循環(huán),呈指數(shù)級擴大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。簡單的說,PCR儀就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制。目前常用的技術,可以將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。
  實時熒光定量PCR儀使用的基本步驟:
  ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃(左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;
  ②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
  ③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。
  實時熒光定量PCR儀重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。反應初期,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,進入線性增長期或靜止期,即出現(xiàn)“停滯效應”,這種效應稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素。大多數(shù)情況下,平臺期的到來是不可避免的。
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