一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時間，也節(jié)約經(jīng)費。

　　三槽梯度PCR儀你真的了解嗎?

　　加熱模塊：上孔與孔之間的溫度一致性對于獲取可靠而可重復(fù)的PCR結(jié)果也是至關(guān)重要的。確保熱準(zhǔn)確性的一種方法就是經(jīng)常使用溫度驗證試劑盒進(jìn)行檢測，溫度驗證檢測通常可用于：

　　在等溫模式下相對于設(shè)定溫度的孔間準(zhǔn)確性；

　　在溫度轉(zhuǎn)換后相對于設(shè)定溫度的孔間準(zhǔn)確性；

　　熱蓋溫度的準(zhǔn)確性。

　　引物退火溫度控制：

　　梯度溫度控制是PCR儀一項有助于PCR中引物退火優(yōu)化的功能。梯度設(shè)定的目的是在模塊之間實現(xiàn)變化的溫度，通過每列之間≥2°C的溫度升降，可同時對于不同溫度進(jìn)行測試以獲取引物退火溫度。理論上，梯度可在模塊之間實現(xiàn)線性的溫度。

　　然而，傳統(tǒng)梯度PCR儀通常采用單一的熱模塊并通過位于兩端的兩個加熱及冷卻元件進(jìn)行溫度的控制，經(jīng)常會導(dǎo)致以下限制：

　　僅能設(shè)置兩個溫度：在熱模塊的兩端設(shè)置成引物退火的高、低溫度，無法在模塊間實現(xiàn)其他溫度的準(zhǔn)確設(shè)置。由于不同列之間的熱交換，模塊上不同區(qū)域間的溫度更可能遵循的是S形的曲線變化而非線性梯度。

　　三槽梯度PCR儀對于樣品溫度控制的能力對于PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性十分重要。儀器特異性的參數(shù)如升降溫速度，維持時間以及算法對于預(yù)測樣品溫度是關(guān)鍵。升降溫速度意味著在一定時間內(nèi)發(fā)生的PCR步驟之間的溫度變化。由于熱量從模塊傳輸至樣品需要一定的時間，樣品實際的升降溫速度會較慢。因此，對于變溫速度的定義需要進(jìn)行區(qū)分和了解。